practica: extracción de ADN (1). SUBMODULO II

EXTRACCIÓN DE ADN (1)

UN EXPERIMENTO AMBIGUO EN EL LABORATORIO DE ENSEÑANZA.

Muchos estudios de biología molecular comienzan con extracción de ácidos nucleicos. La lisis celular libera las moléculas en una fase acusa que es separada de los restos celulares por centrifugación. Las proteínas son removidas de la fase acuosa con solventes orgánicos (FENOL, CLOROFORMO). El ADN que permanece en la fase acuosa se precipita junto al etanol y posteriormente es purificado y re suspendido en búfer adecuado.

La existencia de kits comerciales ha modificado la rutina de muchos laboratorios. En los kits, los solventes orgánicos son sustituidos por filtros que retienen el ADN, en condiciones de alta concentración salina. La elución del ADN retenido en el filtro ocurre en baja concentración salina.

Por alguna razón que se nos escapa la extracción de ADN es una actividad que entusiasma a algunos y decepciona a otros. Probablemente las diferencias de opinión tengan más que ver con la personalidad de los alumnos y sus fantasías que con la actividad en sí. Los pasos posibles de un laboratorio de enseñanza son los siguientes:

1.       Triturar el tejido para separar las células.

2.       Lisis de las membranas celulares con detergente, en una solución salina para liberar los ácidos nucleicos y las proteínas.

3.       Digestión de las proteínas por acción enzimática de proteasas (opcional).

4.       Precipitación con etanol frio. El ADN es soluble en alcohol, pero se torna insoluble con la presencia de la sal (NaCl), porque el sodio neutraliza la carga negativa de los grupos fosfatos. El etanol formara una capa en la superficie por ser menos denso que la solución acuosa.

5.       Observación de agregados moleculares, de consistencia mucoidea, en la interface entre la solución acuosa y el alcohol.

Los agregados moleculares son una mezcla de proporción variable de ácidos nucleicos, proteínas y pectina, un carbohidrato presente en la lamela entre el celular y la vacuola de las células vegetales.

Bibliografía:

MADDEN D. Discovering DNA. Cience in school 1: SPRING 2006. http://www.scienceingschool.org

THE CIENCE BEHIND OUR FOOD http://discover.uga.edu/sbof/index.htm

ACTIVIDAD PRÁCTICA:

OBJETIVO:

Extraer ADN mediante un procedimiento simple. Las membranas celulares y nucleares del tomate son disgregadas con detergente, en solución salina, liberando los ácidos nucleicos que precipitan con el agregado de etanol frio.

MATERIALES:

Un tomate maduro, cuchillo y tabla, dos bolsas plásticas, un vaso de precipitados, un colador de tela, 2ml de detergente, dos o tres granos de sal gruesa, tubos de ensayo y gradilla(sustituibles por frascos pequeños o vasos), una pipeta de 10ml, tubos con 5ml de etanol 95% bien frio, varilla de madera o aguja de crochet.

El etanol debe ser colocado en congelador al menos un día antes de la realización de la práctica.

PROCEDIMIENTO:

1.       Cortar el tomate en trozos pequeños.

2.       Colocar los trozos de tomate en una bolsa de plástico y amasar bien. Si el tomate no estuviera suficientemente maduro o sacara poco jugo, agregar hasta un volumen equivalente de agua.

3.       Agregar la sal gruesa y el detergente al tomate. Mezclar bien.

4.       Luego de 5 a 10 min., filtrar la masa de tomate con un colador de tela.

5.       Distribuir 10ml de líquido filtrado en cada uno de los tubos de ensaye.

6.       Inclinar levemente el primer tubo y muy despacio escurrir 10ml de etanol 95% sobre el líquido. El etanol formara una segunda capa por encima de la solución.

7.       Esperar 10min. Sin mezclar las capas. Y observar el ADN  que precipita en la interface de las dos capas y llega hasta la superficie.

8.       Retirar el ADN con una varilla de madera o con una aguja de crochet.

NUESTRO COMENTARIO:

Desde un punto de vista técnico se trata de una actividad cuyo único requisito es colocar el etanol en el congelador, en un frasco cerrado, al menos un día antes de la realización de la práctica. El tomate puede ser remplazado por frutillas o por un poliploide con alto contenido de ADN.

En el módulo de tecnología de los alimentos del curso de introducción a la tecnología del instituto de tecnología ORT, la actividad práctica de producción de mermeladas introduce un test simple para determinar la proporción de pectina de una fruta. Como el test involucra la precipitación de la pectina con el etanol, pensamos que la mayor parte de los agregados moleculares podrían ser de pectina y no de ADN.